CRISPR/Cas9系统在通过基因治疗人类遗传疾病方面显示出巨大的潜力。然而，人们对该系统的安全性存在担忧，特别是与使用免导向Cas9有关。先前的研究表明，无向导Cas9可以在体外诱导基因组不稳定性。然而，与无向导Cas9相关的体内安全风险尚未得到评估，这对于在临床环境中开发基因治疗是必要的。

2024年7月19 日，中国科学院广州生物医药与健康研究院王可品、赖良学及吴涵共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy 发表题为“In vivo evaluation of guide-free Cas9-induced safety risks in a pig model”的研究论文，研究使用多西环素诱导的Cas9表达猪来评估无向导Cas9在体内的安全性风险。研究结果表明，无向导Cas9的表达可以诱导体内基因组损伤和转录组变化。基因组损伤的严重程度和转录组变化与Cas9蛋白的表达水平相关。

Cas9在猪体内长时间表达导致异常表型，包括体重显著下降，这可能归因于基因组损伤诱导的营养吸收和代谢功能障碍。此外，研究观察到长期Cas9表达的猪的全基因组和肿瘤驱动基因突变增加，增加了肿瘤发生的风险。研究对猪中无向导Cas9的体内评估强调了在临床基因治疗中通过CRISPR / Cas9系统进行基因组编辑时，单独考虑和监测Cas9的有害影响的必要性。本研究强调了进一步研究和实施安全措施的重要性，以确保CRISPR/Cas9系统在临床实践中的成功和安全应用。

CRISPR/Cas9系统由单向导RNA（sgRNA）引导的Cas9蛋白组成，已成为各种生物体中领先的基因组编辑工具。Cas9可以精确靶向特定的基因组序列，并有效诱导DNA双链断裂（DSB）。这些DSB可以通过非同源末端连接（NHEJ）或模板依赖性同源定向修复进行修复，从而分别产生随机插入或缺失或精确点突变和外源性 DNA 片段插入。CRISPR/Cas9系统已被广泛用于生成人类疾病的动物模型，研究基因型-表型关系，以及改善作物和牲畜性状。此外，CRISPR/Cas9介导的基因疗法已应用于治疗各种遗传疾病或难治性疾病的临床试验中。然而，尽管有希望进行临床概念验证，但由于重大安全问题和潜在的免疫原性。

虽然对sgRNA依赖性“脱靶”DSB的担忧引起了人们的极大关注，但使用低脱靶活性的sgRNA、高保真Cas9变体或替代基因编辑方法等策略可以减少这一结果。然而，据报道，Cas9 蛋白可以单独作为独立于外源性 sgRNA 的基因组突变体发挥作用，导致人类细胞中的基因组 DNA DSB 损伤。之前的报告中，研究发现Cas9蛋白在体外诱导猪胚胎的基因组损伤和转录组变化，这可能会损害植入前胚胎的发育。这些发现引发了关于在临床应用中使用CRISPR/Cas9系统的额外安全性问题。然而，到目前为止，对无向导Cas9介导的安全性问题的评估仅限于体外研究。评估单独表达外源性 Cas9 蛋白是否可以诱导体内基因组不稳定性并激活 DNA 损伤反应（DDR）通路至关重要，尤其是对于体内基因治疗。在动物模型中进行这种澄清是必要的。

猪模型中无向导Cas9诱导的基因组损伤分析（图源自Signal Transduction and Targeted Therapy ）

猪和人类有着相似的生理和免疫系统，使猪成为研究基因治疗安全性和有效性的合适动物模型。此前，在猪体内建立了可控、可切换的转基因表达系统，并生成了多西环素（Dox）诱导型 Cas9 表达的猪模型。这种Dox诱导的Cas9表达（DIC）猪模型为本研究提供了独特的优势。首先，该系统在Dox给药后仅表达Cas9蛋白，消除了sgRNA的干扰效应。其次，Cas9蛋白在体内的表达不需要慢病毒、腺相关病毒或脂质纳米颗粒等递送货物，从而提高了效率并排除了递送货物的干扰效应。最后，Cas9蛋白的表达水平和持续时间可以通过Dox给药来严格调节，从而能够评估负面影响与Cas9蛋白的表达时间和水平之间的相关性。因此，DIC猪品系代表了一种理想的大型动物模型，用于研究无向导Cas9在体内的有害影响。

研究结果表明，在Cas9表达两周后，血细胞和组织中发生了显着的基因组损伤和转录组变化。此外，与野生型（WT）猪相比，连续诱导型Cas9表达导致DIC猪的体重显著降低，这可能是由于长期Cas9表达诱导的胃和肠功能异常。对这些表型异常的DIC猪进行全基因组测序（WGS）分析显示，与WT猪相比，整个基因组的基因组突变数量增加，表明肿瘤发生的风险增加。总体而言，这些体内猪数据强调，随着CRISPR/Cas9介导的基因疗法向临床应用迈进，需要单独考虑Cas9蛋白的安全性。

参考消息：https://doi.org/10.1038/s41392-024-01905-1