CRISPR基因组编辑技术自报道以来发展迅速，被广泛应用于哺乳动物细胞的基因组编辑，在基因遗传病的治疗中展现出巨大的发展潜力。目前最为广泛使用的基因组编辑工具主要是Cas9和Cas12a，Cas12a由于其具有比Cas9更高的安全性和精准度而受到人们的广泛关注，但目前Cas12a系统的基因编辑效率较低，极大的限制了其转化应用前景，因此改善Cas12a系统的基因组编辑效率，是一个亟待解决的科学问题。

2021年10月13日，北京大学刘涛团队在Molecular Cell上发表了题为 “Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates” 的研究论文。

研究人员从分子视角理解基因组编辑的过程，CRISPR介导的基因组编辑可以认为三个分子反应的结果：CRISPR蛋白切割DNA，crRNA引导找到靶DNA，靶点DNA。针对CRISPR-Cas12a系统基因编辑效率底下的问题，刘涛团队提出了蛋白质核酸共价偶联复合物的设想，既通过生物正交反应实现Cas12a与crRNA的共价交联，从而将基因编辑中Cas12a、crRNA与基因组DNA之间的三分子反应转化为两分子反应，来实现编辑效率的提升。这一策略的核心问题是如何实现Cas12a与crRNA的共价偶联而不影响自身的切割活性。针对这一问题，刘涛团队利用基因密码子扩展技术在Cas12a蛋白上根据晶体结构定点引入含有叠氮把手的非天然氨基酸，利用无铜催化的点击化学反应可以与5’DBCO修饰的crRNA实现定点偶联，开发了共价Cas12a-crRNA蛋白核酸复合物编辑系统（cCas12a）并将其应用于精准基因编辑及CAR-T制备领域（图1）。

图1 定点修饰Cas12a共价偶连crRNA提高Cas12a系统基因组编辑效率

作者首先评估了该系统在不同细胞中的基因编辑能力和脱靶情况（图2），cCas12a系统可以大幅度提高基因编辑效率，在不同难转细胞系中均展现出良好的基因编辑性能，同时高通量脱靶分析也表明该系统可以提高编辑效率但不会引起显著的脱靶效应的增强，证明了cCas12a系统是一个高效，安全的基因组编辑工具。

图2 利用cCas12a有效提高基因组编辑效率且维持低脱靶水平

Cas12a系统的基因编辑效率的提高大大拓宽了其在生物医药领域的应用前景，作者将其应用于基因组定点整合CAR-T和通用现货型CAR-T均可以实现CAR-T细胞的高效制备（图3），展现出目前报道的最高的定点CAR-T的制备效率。为Cas12a系统的广泛应用奠定了基础，并为其他低效的Cas核酸酶改造提供了思路与方法。

图3 利用cCas12实现精确的基因组高效敲入与定点整合CAR-T细胞的高效制备

综上所述，北京大学药学院分子与细胞药理学系刘涛研究员团队利用基因密码子扩展技术定点修饰Cas12a蛋白，进而与末端修饰DBCO的crRNA分子共价偶连，制备了共价Cas12a-crRNA复合物，有效提高了基于Cas12a系统的基因编辑效率，并用于定点整合CAR-T，为Cas12a的广泛运用及临床研究奠定了基础。

刘涛课题组19级博士生凌鑫宇与20级博士生常丽颖为该论文的共同第一作者，刘涛研究员为通讯作者，北京大学生命科学学院胡家志研究员为该研究在脱靶检测方面提供了帮助。值得一提的是，在前期研究中，刘涛课题组利用类似的策略实现Cas9基因编辑体系中同源重组效率的大幅提升（Science Advances 2020, 8;6(15):eaaz0051）。这两篇工作都获得了国家自然科学基金委，大分子动态修饰与化学干预重大研究计划培育项目（91853111）以及优秀青年基金的资助。

论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276521007735

前期工作：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aaz0051